Agentes etiológicos y principales métodos para la detección del M. leprae.

por Patrícia D. Deps,

Departamento de Medicina Social, Programa de Posgrado en Enfermedades Infecciosas, Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, Espírito Santo, Brasil.

João Marcelo Antunes,

Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Hospital Veterinário Jerônimo Dix-Huit Rosado Maia, Mossoró, Rio Grande do Norte, Brasil.

y Simon M. Collin.

Public Health England, Londres. Reino Unido.

Agentes etiológicos

El M. leprae es un bacilo inmóvil, no cultivable en ambientes artificiales, ligeramente encurvado, ácido alcohol resistente (BAAR), intracelular obligatorio, muestra afinidad por células cutáneas (macrófagos) y de los nervios periféricos (células de Schwann). Su pared célular está compuesta por un complejo covalente ligado al peptidoglicano-arabinogalactano- ácido micólico, bastante similar al que se encuentra en las paredes celulares de otras micobacterias. 1 El glicolípido-fenólico-1 (PGL-1), predominante en la pared celular, es un glicolípido que confiere la capacidad inmunogénica más destacada de M. leprae y puede estar involucrado en la interacción con la lámina de la célula de Schwann.

Aunque el M. leprae no crece en medio de cultivo, el bacilo se multiplica en la almohadilla de la pata del camundongo y en armadillos reproduciendo una cuadro similar a las formas contagiosas de la hanseníase. 2

En 2008 se identificó en México una nueva especie de micobacteria, llamada Mycobacterium lepromatosis, como causa de la hanseníase virchowiana difusa. 3 Después, lo mismo se detectó en África, Asia y Brasil.4

Por análisis genómica comparativa se demostró que el M. lepromatosis parece ser más antiguo en la escala evolutiva cuando comparado con M. leprae. 5

Métodos utilizados en la propedéutica habitual de la enfermedad de Hansen.

Baciloscopía

La Baciloscopía es una prueba de laboratorio que proporciona información sobre la presencia del bacilo de Hansen en el cuerpo de un paciente con sospecha de hanseníase. A través de un examen microscópico, se intenta detectar el bacilo en los raspados intradérmicos de las lesiones dermatológicas o anestésicas, si las hay, de los lóbulos auriculares y de los codos. 6,7

El índice baciloscópico propuesto por Ridley, representa la escala logarítmica con evaluación cuantitativa. De acuerdo con el número de bacilos encontrados en los frotis de linfa retirada de cuatro sitios de la piel, el índice baciloscópico fue estandarizado siendo el resultado positivo representado en número de cruces (+) y adoptado por el Ministerio de Salud desde 1989 (Tabla 1).

Tabla 1 - Índice baciloscópico: criterios de clasificación adoptados por el Ministerio de Salud.

Histopatología

Las diferentes respuestas inmunológicas del huésped determinan las diferentes formas clínicas e histopatológicas del espectro de la hanseníase. Las coloraciones utilizadas son: hematoxilina y eosina, y las coloraciones específicas para BAAR, Ziehl-Neelsen, Wade o Fite-Faraco. 6 Los porta objetos se observan con un microscopio óptico.

Por el método de Ziehl-Neelsen (Figura 1), Wade y Fite-Faraco, los bacilos se presentan coloreados uniformemente en rojo y, cuando viables, en forma de varillas, aislados o en agrupados, formando globias que son características del M. leprae. 8 Estas coloraciones son ampliamente utilizadas para la identificación de bacilos en tejidos, principalmente en fragmentos de piel. La técnica inmunohistoquímica con el marcador BCG (Figura 2) también puede utilizarse para identificar al M. leprae y el bacilo se visualiza en la coloración marrón dorado. Con estos métodos se pueden obtener resultados falsos positivos mediante la identificación de bacterias Gram positivas, de mastocitos y melanofagos por las mismas tinciones. 9,10

Figura 1. Aspectos morfológicos de Mycobacterium leprae utilizando el método Ziehl-Neelsen en un paciente con hanseníase virchowiana. Objetiva de 100x.

La clasificación de Ridley-Jopling fue desarrollada para la investigación científica, pero es utilizada en la práctica clínica en muchas partes del mundo. 11,12 El sistema Ridley-Jopling clasifica la hanseníase como una enfermedad inmunomediada con hanseníase tuberculoide (TT) en un extremo del espectro de la enfermedad y la hanseníase virchowiana (VV) en el otro. La forma (TT) se correlaciona inmunológicamente con la inmunidad celular mediada (IMC) fuerte, mientras que la forma VV se correlaciona con una (IMC) débil. Entre estos dos extremos está el espectro clínicamente inestable, subdividido en dimorfo-tuberculoide (DT), dimorfo-dimorfo (DD), y dimorfo-virchowiana (DV). A continuación aspectos histopatológicos de las formas clínico-inmunológicas:

Figura 2. Inmunoexpresión del antígeno BCG en portador de hanseníase virchowiana (control positivo). Objetiva 40x.

La hanseníase tuberculoide (TT) tiene granulomas con o sin células gigantes de Langhans, nervios dañados e infiltrados por el proceso inflamatorio, las células epitelioides están dispuestas una al lado de la otra. Bacilos raros demostrando una fagocitosis completa, y cuando se producen están casi que exclusivamente en las ramas nerviosas.

La hanseníase dimorfo-tuberculoide (DT) es similar a la TT, pero con bacilos ocasionales, generalmente en los nervios, puede haber zona libre de proceso inflamatorio en la región subepidérmica.

La hanseníase dimorfo-dimorfo (DD) tiene células epitelioides, histiocitos, linfocitos focales, aumento de la celularidad en los nervios, presencia de bacilos localizados en los nervios y la zona subepidérmica libre.

La hanseníase dimorfo-virchowiana (DV) muestra histiocitos, pocas células epitelioides, células espumosas o de Virchow (macrófagos o histiocitos que contienen grandes números de bacilos), presencia de bacilos en los nervios, y zona subepidérmica libre.6

La hanseníase virchowiana está constituida por un granuloma de tipo histio-monocitario. Presencia de células de Virchow. El cuadro está compuesto por pocos linfocitos, numerosos bacilos nerviosos, mínima infiltración celular intraneural y zona subepidérmica libre.

La hanseníase indeterminada presenta un infiltrado inflamatorio no específico, constituido por linfocitos e histiocitos no diferenciados, alrededor de los nervios y apéndices cutáneos. Raros bacilos.

Métodos serológicos

Las técnicas serológicas como el ELISA y el flujo lateral (ML Flow) detectan la presencia de anticuerpos de clase IgM anti-PGL-1. 13. La molécula de PGL-I está compuesta por el trisacárido 3,6-di-O-metil-beta-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3-di-O-metil-alfa-L- ramnopiranosil-(1-2)-3-O-metil-alfa-L-ramnopiranosil. 14. La eliminación del azúcar terminal resulta en pérdida de la unión de la mayoría de los anticuerpos, mientras que la eliminación de la cadena larga de ácidos grasos de la molécula PGL-I no produce efecto sobre la unión de los anticuerpos.

Esta información sugiere que la síntesis química de la última parte del disacárido produce un epítopo que estimula la producción de anticuerpos monoclonales, utilizados en la detección de la presencia de PGL-I. 15 La síntesis de azúcares (di- o trisacáridos naturales, ND o NT, respectivamente), seguida de la identificación del azúcar terminal como antígeno primario determinante del PGL-I y su vínculo con la albúmina de suero bovino, (“bovine serum albumine”, BSA) con un anillo octil (O), o un anillo fenólico (P), puede producir antígenos semisintéticos.16 El antígeno ND-O-BSA fue considerado igual o mejor que los derivados del antígeno PGL-I, tanto los naturales como los sintéticos. 17

La potente respuesta inmune al PGL-1, con producción de IgM, es proporcional a la carga bacilar,18 y es específica de cada especie. 19

LID-1 es una fusión de dos proteínas de M. leprae (ML0405 y ML2331) para detectar anticuerpos IgG, 20 mientras que el NDO-LID combina el LID-1 con un mimetopo sintético PGL-1 IgM. 21 Ya el rMLP15 es un polipéptido recombinante purificado de seis proteínas (ML1358, ML2055, ML0885, ML1811, ML1812 y ML1214). 22

Las revisiones sistemáticas no han podido identificar una técnica serológica con un rendimiento concluyentemente superior en términos de sensibilidad y especificidad, debido a la heterogeneidad entre los estudios, pero todas las técnicas serológicas tienen desempeño deficiente en la detección de la hanseníase paucibacilar. 23-25

La tabla 2 muestra los antígenos y algunas de sus características utilizadas en la técnicas serológicas.

Tabla 2 - Antígenos utilizados en el diagnóstico de la hanseníase.

Métodos genómicos

Un paso importante para entender la biología del M. leprae fue la obtención del secuenciamiento de su genoma, el cual tiene menos contenido de Guanina y Citosina si comparado con el encontrado en el M. tuberculosis. 26 Tiene aproximadamente 4.000 genes que codifican las proteínas, el 27% son genes degenerados (pseudogenes) y el 2% está compuesto por secuencias repetitivas.

Después del secuenciamiento del genoma de M. leprae, comenzaron las investigaciones para encontrar las secuencias repetitivas en el genoma, número variable de repeticiones en tandem (VNTRs) y Short Tandem Repeats (STRs), 27 y polimorfismos de base única (SNPs) con el objetivo de diferenciar las cepas de esta bacteria. Estas técnicas se han utilizado para comprender la diversidad genética de este patógeno, así como dilucidar aspectos relativos a la difusión y las lagunas epidemiológicas de la hanseníase. 28

Inicialmente, estos análisis revelaron sólo cuatro SNPs (SNP tipos 1, 2, 3 y 4). 29 Sin embargo, enfoques más recientes, que incluyen 78 SNP informativos, permitieron clasificar al M. leprae en 16 subtipos, para los cuales también fue posible hacer una correlación entre el origen geográfico del hanseniano y el perfil del SNP. 30

PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus derivados se desarrollaron para ayudar en el diagnóstico de la hanseníase. 31,32

Se utilizaron diferentes secuencias como objetivos para la PCR. Son estudiados los genes que codifican el antígeno de 36-kDa, el antígeno de 18-kDa, el antígeno de 65-kDa, complejo 85, 16S rDNA, hsp65 (heat shock protein 65) y la secuencia repetitiva RLEP. Las técnicas de PCR en tiempo real (qPCR) mejoraron la sensibilidad y la especificidad en la detección del M. leprae. 33

Aunque la PCR es potencialmente útil en el diagnóstico de casos difíciles como la hanseníase neural pura, hanseníase paucibacilar y pacientes con presentación clínica atípica, no se utiliza en la práctica clínica habitual. 33,34

Análogamente, aunque las técnicas genómicas, como el secuenciamiento de la próxima generación (NGS) sean útiles en la investigación científica, es poco probable que tengan utilidad clínica en escenarios endémicos de hanseníase. 35

La tabla 3 demuestra los marcadores y algunas de sus características utilizadas en las técnicas de PCR.

Tabla 3 - Marcadores utilizados en la detección del ADN del M. leprae

Leyenda: Real Time-PCR (qPCR); Sensibilidad (S); Especificidad (E);MB (Multibacilar); PB (Paucibacilar).

Colaboradores académicos

Génèse Faïrana Godeline Essali,

Júlia Salarini Carneiro y

Lavínia Damacena Perin

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