Agentes etiológicos y principales métodos para la detección del M. leprae.

por Patrícia D. Deps,

Departamento de Medicina Social, Programa de Posgrado en Enfermedades Infecciosas, Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, Espírito Santo, Brasil.

Jo√£o Marcelo Antunes,

Universidade Federal Rural do Semi-√Ārido, Hospital Veterin√°rio Jer√īnimo Dix-Huit Rosado Maia, Mossor√≥, Rio Grande do Norte, Brasil.

y Simon M. Collin.

Public Health England, Londres. Reino Unido.

Agentes etiológicos

El M. leprae es un bacilo inmóvil, no cultivable en ambientes artificiales, ligeramente encurvado, ácido alcohol resistente (BAAR), intracelular obligatorio, muestra afinidad por células cutáneas (macrófagos) y de los nervios periféricos (células de Schwann). Su pared célular está compuesta por un complejo covalente ligado al peptidoglicano-arabinogalactano- ácido micólico, bastante similar al que se encuentra en las paredes celulares de otras micobacterias. 1 El glicolípido-fenólico-1 (PGL-1), predominante en la pared celular, es un glicolípido que confiere la capacidad inmunogénica más destacada de M. leprae y puede estar involucrado en la interacción con la lámina de la célula de Schwann.

Aunque el M. leprae no crece en medio de cultivo, el bacilo se multiplica en la almohadilla de la pata del camundongo y en armadillos reproduciendo una cuadro similar a las formas contagiosas de la hanseníase. 2

En 2008 se identific√≥ en M√©xico una nueva especie de micobacteria, llamada Mycobacterium lepromatosis, como causa de la hansen√≠ase virchowiana difusa. 3 Despu√©s, lo mismo se detect√≥ en √Āfrica, Asia y Brasil.4

Por análisis genómica comparativa se demostró que el M. lepromatosis parece ser más antiguo en la escala evolutiva cuando comparado con M. leprae. 5

Métodos utilizados en la propedéutica habitual de la enfermedad de Hansen.

Baciloscopía

La Baciloscopía es una prueba de laboratorio que proporciona información sobre la presencia del bacilo de Hansen en el cuerpo de un paciente con sospecha de hanseníase. A través de un examen microscópico, se intenta detectar el bacilo en los raspados intradérmicos de las lesiones dermatológicas o anestésicas, si las hay, de los lóbulos auriculares y de los codos. 6,7

El √≠ndice bacilosc√≥pico propuesto por Ridley, representa la escala logar√≠tmica con evaluaci√≥n cuantitativa. De acuerdo con el n√ļmero de bacilos encontrados en los frotis de linfa retirada de cuatro sitios de la piel, el √≠ndice bacilosc√≥pico fue estandarizado siendo el resultado positivo representado en n√ļmero de cruces (+) y adoptado por el Ministerio de Salud desde 1989 (Tabla 1).

Tabla 1 - √ćndice bacilosc√≥pico: criterios de clasificaci√≥n adoptados por el Ministerio de Salud.

Histopatología

Las diferentes respuestas inmunológicas del huésped determinan las diferentes formas clínicas e histopatológicas del espectro de la hanseníase. Las coloraciones utilizadas son: hematoxilina y eosina, y las coloraciones específicas para BAAR, Ziehl-Neelsen, Wade o Fite-Faraco. 6 Los porta objetos se observan con un microscopio óptico.

Por el método de Ziehl-Neelsen (Figura 1), Wade y Fite-Faraco, los bacilos se presentan coloreados uniformemente en rojo y, cuando viables, en forma de varillas, aislados o en agrupados, formando globias que son características del M. leprae. 8 Estas coloraciones son ampliamente utilizadas para la identificación de bacilos en tejidos, principalmente en fragmentos de piel. La técnica inmunohistoquímica con el marcador BCG (Figura 2) también puede utilizarse para identificar al M. leprae y el bacilo se visualiza en la coloración marrón dorado. Con estos métodos se pueden obtener resultados falsos positivos mediante la identificación de bacterias Gram positivas, de mastocitos y melanofagos por las mismas tinciones. 9,10

Figura 1. Aspectos morfológicos de Mycobacterium leprae utilizando el método Ziehl-Neelsen en un paciente con hanseníase virchowiana. Objetiva de 100x.

La clasificación de Ridley-Jopling fue desarrollada para la investigación científica, pero es utilizada en la práctica clínica en muchas partes del mundo. 11,12 El sistema Ridley-Jopling clasifica la hanseníase como una enfermedad inmunomediada con hanseníase tuberculoide (TT) en un extremo del espectro de la enfermedad y la hanseníase virchowiana (VV) en el otro. La forma (TT) se correlaciona inmunológicamente con la inmunidad celular mediada (IMC) fuerte, mientras que la forma VV se correlaciona con una (IMC) débil. Entre estos dos extremos está el espectro clínicamente inestable, subdividido en dimorfo-tuberculoide (DT), dimorfo-dimorfo (DD), y dimorfo-virchowiana (DV). A continuación aspectos histopatológicos de las formas clínico-inmunológicas:

Figura 2. Inmunoexpresión del antígeno BCG en portador de hanseníase virchowiana (control positivo). Objetiva 40x.

La hansen√≠ase tuberculoide (TT) tiene granulomas con o sin c√©lulas gigantes de Langhans, nervios da√Īados e infiltrados por el proceso inflamatorio, las c√©lulas epitelioides est√°n dispuestas una al lado de la otra. Bacilos raros demostrando una fagocitosis completa, y cuando se producen est√°n casi que exclusivamente en las ramas nerviosas.

La hanseníase dimorfo-tuberculoide (DT) es similar a la TT, pero con bacilos ocasionales, generalmente en los nervios, puede haber zona libre de proceso inflamatorio en la región subepidérmica.

La hanseníase dimorfo-dimorfo (DD) tiene células epitelioides, histiocitos, linfocitos focales, aumento de la celularidad en los nervios, presencia de bacilos localizados en los nervios y la zona subepidérmica libre.

La hansen√≠ase dimorfo-virchowiana (DV) muestra histiocitos, pocas c√©lulas epitelioides, c√©lulas espumosas o de Virchow (macr√≥fagos o histiocitos que contienen grandes n√ļmeros de bacilos), presencia de bacilos en los nervios, y zona subepid√©rmica libre.6

La hanseníase virchowiana está constituida por un granuloma de tipo histio-monocitario. Presencia de células de Virchow. El cuadro está compuesto por pocos linfocitos, numerosos bacilos nerviosos, mínima infiltración celular intraneural y zona subepidérmica libre.

La hanseníase indeterminada presenta un infiltrado inflamatorio no específico, constituido por linfocitos e histiocitos no diferenciados, alrededor de los nervios y apéndices cutáneos. Raros bacilos.

Métodos serológicos

Las t√©cnicas serol√≥gicas como el ELISA y el flujo lateral (ML Flow) detectan la presencia de anticuerpos de clase IgM anti-PGL-1. 13. La mol√©cula de PGL-I est√° compuesta por el trisac√°rido 3,6-di-O-metil-beta-D-glucopiranosil-(1-4)-2,3-di-O-metil-alfa-L- ramnopiranosil-(1-2)-3-O-metil-alfa-L-ramnopiranosil. 14. La eliminaci√≥n del az√ļcar terminal resulta en p√©rdida de la uni√≥n de la mayor√≠a de los anticuerpos, mientras que la eliminaci√≥n de la cadena larga de √°cidos grasos de la mol√©cula PGL-I no produce efecto sobre la uni√≥n de los anticuerpos.

Esta informaci√≥n sugiere que la s√≠ntesis qu√≠mica de la √ļltima parte del disac√°rido produce un ep√≠topo que estimula la producci√≥n de anticuerpos monoclonales, utilizados en la detecci√≥n de la presencia de PGL-I. 15 La s√≠ntesis de az√ļcares (di- o trisac√°ridos naturales, ND o NT, respectivamente), seguida de la identificaci√≥n del az√ļcar terminal como ant√≠geno primario determinante del PGL-I y su v√≠nculo con la alb√ļmina de suero bovino, (‚Äúbovine serum albumine‚ÄĚ, BSA) con un anillo octil (O), o un anillo fen√≥lico (P), puede producir ant√≠genos semisint√©ticos.16 El ant√≠geno ND-O-BSA fue considerado igual o mejor que los derivados del ant√≠geno PGL-I, tanto los naturales como los sint√©ticos. 17

La potente respuesta inmune al PGL-1, con producción de IgM, es proporcional a la carga bacilar,18 y es específica de cada especie. 19

LID-1 es una fusión de dos proteínas de M. leprae (ML0405 y ML2331) para detectar anticuerpos IgG, 20 mientras que el NDO-LID combina el LID-1 con un mimetopo sintético PGL-1 IgM. 21 Ya el rMLP15 es un polipéptido recombinante purificado de seis proteínas (ML1358, ML2055, ML0885, ML1811, ML1812 y ML1214). 22

Las revisiones sistem√°ticas no han podido identificar una t√©cnica serol√≥gica con un rendimiento concluyentemente superior en t√©rminos de sensibilidad y especificidad, debido a la heterogeneidad entre los estudios, pero todas las t√©cnicas serol√≥gicas tienen desempe√Īo deficiente en la detecci√≥n de la hansen√≠ase paucibacilar. 23-25

La tabla 2 muestra los antígenos y algunas de sus características utilizadas en la técnicas serológicas.

Tabla 2 - Antígenos utilizados en el diagnóstico de la hanseníase.

Métodos genómicos

Un paso importante para entender la biología del M. leprae fue la obtención del secuenciamiento de su genoma, el cual tiene menos contenido de Guanina y Citosina si comparado con el encontrado en el M. tuberculosis. 26 Tiene aproximadamente 4.000 genes que codifican las proteínas, el 27% son genes degenerados (pseudogenes) y el 2% está compuesto por secuencias repetitivas.

Despu√©s del secuenciamiento del genoma de M. leprae, comenzaron las investigaciones para encontrar las secuencias repetitivas en el genoma, n√ļmero variable de repeticiones en tandem (VNTRs) y Short Tandem Repeats (STRs), 27 y polimorfismos de base √ļnica (SNPs) con el objetivo de diferenciar las cepas de esta bacteria. Estas t√©cnicas se han utilizado para comprender la diversidad gen√©tica de este pat√≥geno, as√≠ como dilucidar aspectos relativos a la difusi√≥n y las lagunas epidemiol√≥gicas de la hansen√≠ase. 28

Inicialmente, estos análisis revelaron sólo cuatro SNPs (SNP tipos 1, 2, 3 y 4). 29 Sin embargo, enfoques más recientes, que incluyen 78 SNP informativos, permitieron clasificar al M. leprae en 16 subtipos, para los cuales también fue posible hacer una correlación entre el origen geográfico del hanseniano y el perfil del SNP. 30

PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus derivados se desarrollaron para ayudar en el diagnóstico de la hanseníase. 31,32

Se utilizaron diferentes secuencias como objetivos para la PCR. Son estudiados los genes que codifican el antígeno de 36-kDa, el antígeno de 18-kDa, el antígeno de 65-kDa, complejo 85, 16S rDNA, hsp65 (heat shock protein 65) y la secuencia repetitiva RLEP. Las técnicas de PCR en tiempo real (qPCR) mejoraron la sensibilidad y la especificidad en la detección del M. leprae. 33

Aunque la PCR es potencialmente √ļtil en el diagn√≥stico de casos dif√≠ciles como la hansen√≠ase neural pura, hansen√≠ase paucibacilar y pacientes con presentaci√≥n cl√≠nica at√≠pica, no se utiliza en la pr√°ctica cl√≠nica habitual. 33,34

An√°logamente, aunque las t√©cnicas gen√≥micas, como el secuenciamiento de la pr√≥xima generaci√≥n (NGS) sean √ļtiles en la investigaci√≥n cient√≠fica, es poco probable que tengan utilidad cl√≠nica en escenarios end√©micos de hansen√≠ase. 35

La tabla 3 demuestra los marcadores y algunas de sus características utilizadas en las técnicas de PCR.

Tabla 3 - Marcadores utilizados en la detección del ADN del M. leprae

Leyenda: Real Time-PCR (qPCR); Sensibilidad (S); Especificidad (E);MB (Multibacilar); PB (Paucibacilar).
Colaboradores académicos

G√©n√®se Fa√Įrana Godeline Essali,

J√ļlia Salarini Carneiro y

Lavínia Damacena Perin

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